Provas de Identificação

PROVA DE CATALASE


PRINCÍPIO

  • A catalase é uma enzima que decompõe o peróxido de hidrogênio (H2O2) em água e oxigênio.

UTILIDADE

  • Para Staphylococcus, Streptococcus, Enterococcus, Listeria, Corynebacterium, Micrococcus, Bacillus, Moraxella catarrhalis.

FÓRMULA/ PRODUTO

  • Peróxido de Hidrogênio (H2O2) 3%.

CONTROLE DE QUALIDADE

  • Positivo: cepa de Staphylococcus aureus ATCC 25923 ou Staphylococcus epidermidis ATCC 12228.
  • Negativo: cepa de Streptococcus do grupo viridans ou Streptococcus pneumoniae ATCC 6305.

CONSERVAÇÃO E VALIDADE

  • peróxido de hidrogênio deve ser mantido em local seco, ao abrigo de luz e calor.
  • Validade: ver recomendações do fabricante.

INOCULAÇÃO

  • Colocar uma gota de peróxido de hidrogênio (água oxigenada) 3% sobre uma lâmina;
  • Com auxílio de fio bacteriológico, agregar a colônia em estudo na gota de peróxido de hidrogênio.

INTERPRETAÇÃO

  • Positivo: Presença imediata de bolhas - a produção de efervescência indica a conversão do H2O2 em água e oxigênio gasoso.
  • Negativo: Ausência de bolhas ou efervescência.


RECOMENDAÇÕES

  • Evitar o uso de meios contendo sangue, pois os eritrócitos podem produzir reação fraca de catalase.
  • Para uso de outra cepa de Staphylococcus para o controle positivo, não usar cepas de Staphylococcus saccharolyticus e Staphylococcus aureus subsp. anaerobius, pois são catalase negativos.



PROVA DE COAGULASE

PRINCÍPIO
  • Verificar a capacidade de microrganismos reagirem com o plasma e formarem um coágulo, uma vez que a coagulase é uma proteína com atividade similar à protombrina, capaz de converter o fibrinogênio em fibrina, que resulta na formação de um coágulo visível.
  • Pode ser encontrada em duas formas que possuem diferentes propriedades: coagulase conjugada e coagulase livre.
  • A coagulase conjugada (prova em lâmina), é também conhecida como fator de aglutinação, encontra-se unida à parede celular bacteriana e não está presente em filtrados de cultivos. Quando as células bacterianas são suspensas em plasma (fibrinogênio), formam-se cordões de fibrina entre elas, o que causa agrupamento sob a forma de grumos visíveis.
  • A coagulase livre (prova em tubo), é uma substância similar à trombina e está presente em filtrados de cultivos. É secretada extracelularmente e reage com uma substância presente no plasma denominado Fator de Reação com a Coagulase – CRF, para formar um complexo que, por sua vez, reage com fibrinogênio, formando fibrina (coágulos).
  • Quando uma suspensão em plasma do microrganismo produtor de coagulase é preparada em tubo de ensaio, forma-se um coágulo visível após o período de incubação.


UTILIDADE
  • Separar as espécies de Staphylococcus de importância clínica, S. aureus – coagulase positiva, das demais espécies – coagulase negativa.

FÓRMULA / PRODUTO
  • Plasma de coelho com EDTA liofilizado.

CONTROLE DE QUALIDADE
  • Positivo: Staphylococcus aureus ATCC 25923
  • Negativo: Staphylococcus epidermidis ATCC 12228

CONSERVAÇÃO E VALIDADE
  • plasma antes e depois de reconstituído, deve ser mantido refrigerado.
  • Validade: ver recomendações do fabricante.

INOCULAÇÃO

Coagulase conjugada:
  • Traçar dois círculos com lápis de cera em uma lâmina de vidro;
  • Colocar duas gotas de água destilada ou solução fisiológica estéreis dentro de cada círculo;
  • Com auxílio de um fio bacteriológico agregar a colônia em estudo, homogeneizando delicadamente em cada círculo;
  • Colocar uma gota de plasma para a prova de coagulase em um dos círculos;
  • No outro círculo, adicionar outra gota de água destilada ou solução fisiológica estéreis, como controle;
  • Homogeneizar com palito de madeira;
  • Inclinar a lâmina delicadamente, para frente e para trás;
  • Observar presença de aglutinação.

Coagulase livre:
  • Com auxílio do fio bacteriológico, suspender colônias em estudo em caldo BHI e colocar em estufa à 37ºC até que turve;
  • Se necessário, acertar a turbidez até 0,5 da escala de MacFarland;
  • Em um tubo de ensaio estéril, colocar 0,5 ml de plasma reconstituído e 0,5 ml do caldo BHI com crescimento bacteriano recém turvado;
  • Incubar em estufa à 35ºC 4 horas;
  • Verificar se há presença de coágulo;
  • Se não houver presença de coágulo, incubar o tubo em temperatura ambiente e repetir as leituras com 18 e 24 horas de incubação.


INTERPRETAÇÃO
Coagulase conjugada:
  • Positiva: formação de precipitado branco e aglutinação dos microrganismos da suspensão, após 15 segundos, no círculo que contém o plasma.
  • Negativa: ausência de aglutinação no círculo que contém o plasma.
  • Controle sem plasma: deverá ser leitoso e uniforme, sem presença de precipitado ou aglutinação.

A presença de precipitado ou aglutinação, torna a prova inespecífica, devendo ser repetida a prova
em tubo.

Coagulase livre:
  • Positiva: presença de qualquer grau de coágulo.
  • Negativa: ausência de coágulo.

RECOMENDAÇÕES
  • Para a coagulase em tubo, as provas negativas após 4 horas a 37ºC, os tubos devem ser mantidos em temperatura ambiente, pois a incubação prolongada a 37ºC podem produzir fibronolisinas, o que causa dissolução do coágulo durante a incubação.
  • Durante a leitura inclinar o tubo delicadamente e não agitar, pois a agitação pode desmanchar os coágulos parcialmente formados.
  • Recomenda-se o uso de plasma de coelho com EDTA.
  • Não utilizar plasma citratado, pois os microrganismos capazes de metabolizar o citrato (como os Enterococcus), darão resultados positivos se, forem confundidos com estafilococos.
  • Plasma humano não é recomendado, pois contém quantidades variadas de Fator de Reação com a Coagulase e de anticorpos antiestafilococos, podendo dar uma prova falso/ negativa.



PROVA DE GELATINASE

PRINCÍPIO
  • Determina a habilidade do microrganismo de produzir enzimas proteolíticas (gelatinases) que liquefaz/hidrolisa gelatina.

UTILIDADE
  • Identificar e classificar bactérias fermentadoras, não fermentadoras e bacilos Gram positivos esporulados.

FÓRMULA / PRODUTO
  • Filme não revelado de Raio X.
  • Salina 0,9 % estéril ou água destilada estéril.

PROCEDIMENTOS
  • Cortar a fita de filme de Raio X em tamanhos de aproximadamente 5 mm X 1 cm;
  • Armazenar em frasco estéril.

CONTROLE DE QUALIDADE
  • Positivo: Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853.
  • Negativo: Escherichia coli ATCC 25922.

INOCULAÇÃO
  • Em um tubo 13 x 100 mm, colocar 1,0 ml de salina 0,9% estéril ou água destilada estéril.;
  • Com o auxílio de uma alça bacteriológica, fazer um inóculo denso da bactéria a ser testada, adicionar uma fita de raio x. Fazer o inóculo de colônias de crescimento de 18 a 24 horas;
  • Realizar um tubo controle, com salina 0,9% estéril ou água destilada estéril e a fita de Raio X, sem inóculo.

INTERPRETAÇÃO
  • Positivo: emulsão de gelatina (cor verde) na porção submersa do filme torna-se transparente (clara).
  • Negativo: fita permanece verde, emulsão esverdeada permanece na porção submersa do filme.

CONSERVAÇÃO E VALIDADE
  • Fitas: seguir instruções do fabricante.

RECOMENDAÇÕES
  • Utilizar filme de Raio X não revelado.




ÁGAR CITRATO SIMMONS

PRINCÍPIO
  • Verifica a capacidade da bactéria de utilizar o citrato de sódio como única fonte de carbono, juntamente com sais de amônia, alcalinizando o meio.

UTILIDADE
  • Diferenciar gêneros e espécies de enterobactérias e não fermentadores.

FÓRMULA / PRODUTO
  • Meio comercial: Citrato Simmons.

PROCEDIMENTOS
  • Pesar e hidratar o meio segundo instruções do fabricante;
  • Ajustar o pH para 6,9 ±0,2;
  • Aquecer sob agitação até fundir o ágar;
  • Distribuir em tubos com tampas de rosca;
  • Esterilizar em autoclave;
  • Retirar os tubos da autoclave e incliná-los ainda quentes, para que solidifiquem com a superfície em forma de bico de flauta (ângulo de 45°). Deixar solidificar em temperatura ambiente.


CONTROLE DE QUALIDADE
  • Positivo: Klebsiella pneumoniae ATCC 13883.
  • Negativo: Escherichia coli ATCC 25922.

INOCULAÇÃO
  • Com o auxílio de um fio bacteriológico, inocular na superfície a colônia, não furar a base;
  • Realizar o teste com colônias puras de 18 a 24 horas.

INTERPRETAÇÃO
  • Cor original do meio: verde
  • Positivo: cor azul ou crescimento no local do inóculo.
  • Negativo: não há crescimento e a cor permanece inalterada.
  • Se houver crescimento visual na área do inóculo sem mudança de cor, o teste pode ser considerado positivo, reincubar por 24 até 72 horas, a incubação poderá mudar a cor do meio para alcalino (azul).

Leitura inicial com 24 horas:
  • Se resultado positivo: encerrar o teste.
  • Se resultado negativo ou houver dúvida: reincubar por mais 24/48 horas.

Leitura com 48 horas:
  • Se houver crescimento visível na área do inóculo sem mudança de cor, o teste pode ser considerado positivo, (encerrar o teste).
  • Se resultado negativo ou houver dúvida, reincubar por 24 até 72 horas, a incubação poderá mudar a cor do meio para alcalino(azul).

CONSERVAÇÃO E VALIDADE
  • Conservar de 4 a 10°C de 6 a 8 semanas;
  • Após este período realizar controles negativo e positivo semanalmente.


RECOMENDAÇÕES
  • Manter a tampa do tubo frouxa, o meio necessita de oxigênio.
  • Não se devem transportar colônias de meios que contenham glicose ou outros nutrientes/substratos, pois podem entrar em contato com o meio de citrato, podendo dar um resultado falso positivo.
  • Se algum resultado estiver duvidoso, inocular um novo tubo e incubar em temperatura ambiente (22 a 25°C) por até 7 dias.
  • Não usar repiques de caldo.
  • Deixar o tubo em temperatura ambiente antes de inocular a bactéria.
  • Para fazer o inóculo flambar o fio bacteriológico.
  • Não fazer inóculo muito denso (pode acidificar o meio deixando-o amarelo).



ÁGAR BÍLIS-ESCULINA

PRINCÍPIO
  • A prova de Bile-Esculina é baseada na capacidade de algumas bactérias hidrolisarem esculina em presença de bílis. A esculina é um derivado glicosídico da cumarina. As duas moléculas do composto (glicose e 7-hidroxicumarina) estão unidas por uma ligação éster através do oxigênio. A esculina é incorporada em um meio contendo 4% de sais biliares.
  • As bactérias Bile-Esculina POSITIVAS, são capazes de crescer em presença de sais biliares. A hidrólise da esculina no meio resulta na formação de glicose e esculetina. A esculetina reage com íons férricos (fornecidos pelo composto inorgânico do meio - o citrato férrico), formando um complexo negro.
UTILIDADE
  • Separação dos Streptococcus Bile-Esculina positiva dos Bile-Esculina negativa.
  • Identificação dos Enterococcus spp., que são Bile-Esculina positiva.
  • Identificação de bacilos Gram negativos não fermentadores e enterobactérias, usar o meio sem bílis (vide prova de esculina).
FÓRMULA/ PRODUTO
  • Meio comercial: Ágar Bílis-Esculina
Fórmula: 
    • Peptona 5 g
    • Extrato de carne 3 g
    • Bílis 40 g
    • Esculina 1 g
    • Citrato férrico 0,5 g
    • Ágar 15 g
    • Água destilada 1000 ml
    • pH = 7,0
PROCEDIMENTOS
  • Pesar e hidratar o meio conforme instruções do fabricante;
  • Fundir o meio;
  • Distribuir 2,5 ml por tubo;
  • Esterilizar em autoclave;
  • Após retirar da autoclave, inclinar os tubos ainda quentes para que solidifiquem com a superfície em forma de "bico de flauta" (ângulo de 45º).
CONTROLE DE QUALIDADE
  • Positivo: Enterococcus faecalis ATCC 29212.
  • Negativo: Streptococcus pyogenes ATCC 19615.
CONSERVAÇÃO E VALIDADE
  • Conservar de 4 a 10°C por 4 meses.
INOCULAÇÃO
  • Estriar a superfície inclinada do meio;
  • Incubar a 35ºC 24 horas.
INTERPRETAÇÃO
Cor original do meio: acinzentado
  • Positivo: Enegrecimento em pelo menos metade ou mais do meio.
  • Negativo: Ausência de enegrecimento ou crescimento de menos da metade do meio após 72 horas de incubação.
RECOMENDAÇÕES
  • Provas negativas com 24 horas de incubação, recomenda-se período de incubação maior (48 horas).
  • Alguns Streptococcus do grupo viridans (cerca de 3%) podem hidrolizar a esculina em presença de bílis se incubados em atmosfera de CO2.






ÁGAR SANGUE - CAMP


PRINCÍPIO
  • Consiste na interação da beta hemólise secretada pelo Staphylococcus aureus com o microrganismo em estudo, que secreta uma proteína, denominada "fator CAMP", produzindo aumento de hemólise no local da inoculação.

UTILIDADE
  • Separação do Streptococcus beta hemolítico presumível do grupo B de Lancefield (S. agalactiae) e da Listeria monocytogenes (CAMP positivos) dos demais Streptococcus beta hemolíticos e espécies de Listeria.

FÓRMULA/ PRODUTO
Para esta prova utiliza-se:
  • Placa de meio Ágar Sangue.
  • Cepa de Staphylococcus aureus produtora de beta hemolisina ATCC 25923.

CONTROLE DE QUALIDADE
  • Positivo: Streptococcus agalactiae ATCC 13813.
  • Negativo: Streptococcus pyogenes ATCC 19615.

INOCULAÇÃO
  • Com auxílio do fio bacteriológico, semear na superfície de meio Ágar Sangue a cepa de Staphylococcus aureus com uma única linha reta;
  • Novamente com o fio bacteriológico (flambado), tocar nas colônias em estudo;
  • Semear uma única linha reta na superfície do meio Ágar Sangue, perpendicularmente à linha de semeadura do S. aureus, sem tocar no inóculo do S. aureus;
  • Logo em seguida, sem flambar o fio, picar o meio Ágar Sangue duas vezes, uma de cada lado da semeadura da cepa em estudo, sem tocar nas duas linhas de inóculo já feitos (a do S. aureus e da cepa em estudo);
  • Incubar à 35ºC 24 horas.


(a) Inóculo do S. aureus
(b) Inóculo da cepa em estudo

INTERPRETAÇÃO
  • Positivo: Aumento da área de hemólise em forma de flecha no local onde estão mais próximas as duas estrias de crescimento.
  • Negativo: Ausência de aumento da hemólise. Observa-se nitidamente a hemólise do S. aureus e da cepa em estudo, inalteradas.

RECOMENDAÇÃO
  • Não utilizar cepas velhas de S. aureus, pois podem não produzir beta hemolisina.
  • Não tocar as estrias da semeadura das cepas, para não dar um resultado falso – negativo.
  • Não utilizar placas de Ágar Sangue velhas que dificultem a leitura da prova, já que é baseada na hemólise das cepas.