PROVA DE CATALASE
PRINCÍPIO
- A catalase é uma enzima que decompõe o peróxido de hidrogênio (H2O2) em água e oxigênio.
UTILIDADE
- Para Staphylococcus, Streptococcus, Enterococcus, Listeria, Corynebacterium, Micrococcus, Bacillus, Moraxella catarrhalis.
FÓRMULA/ PRODUTO
- Peróxido de Hidrogênio (H2O2) 3%.
CONTROLE DE QUALIDADE
- Positivo: cepa de Staphylococcus aureus ATCC 25923 ou Staphylococcus epidermidis ATCC 12228.
- Negativo: cepa de Streptococcus do grupo viridans ou Streptococcus pneumoniae ATCC 6305.
CONSERVAÇÃO E VALIDADE
- peróxido de hidrogênio deve ser mantido em local seco, ao abrigo de luz e calor.
- Validade: ver recomendações do fabricante.
INOCULAÇÃO
- Colocar uma gota de peróxido de hidrogênio (água oxigenada) 3% sobre uma lâmina;
- Com auxílio de fio bacteriológico, agregar a colônia em estudo na gota de peróxido de hidrogênio.
INTERPRETAÇÃO
- Positivo: Presença imediata de bolhas - a produção de efervescência indica a conversão do H2O2 em água e oxigênio gasoso.
- Negativo: Ausência de bolhas ou efervescência.
RECOMENDAÇÕES
- Evitar o uso de meios contendo sangue, pois os eritrócitos podem produzir reação fraca de catalase.
- Para uso de outra cepa de Staphylococcus para o controle positivo, não usar cepas de Staphylococcus saccharolyticus e Staphylococcus aureus subsp. anaerobius, pois são catalase negativos.
PROVA DE COAGULASE
PRINCÍPIO
- Verificar a capacidade de microrganismos reagirem com o plasma e formarem um coágulo, uma vez que a coagulase é uma proteína com atividade similar à protombrina, capaz de converter o fibrinogênio em fibrina, que resulta na formação de um coágulo visível.
- Pode ser encontrada em duas formas que possuem diferentes propriedades: coagulase conjugada e coagulase livre.
- A coagulase conjugada (prova em lâmina), é também conhecida como fator de aglutinação, encontra-se unida à parede celular bacteriana e não está presente em filtrados de cultivos. Quando as células bacterianas são suspensas em plasma (fibrinogênio), formam-se cordões de fibrina entre elas, o que causa agrupamento sob a forma de grumos visíveis.
- A coagulase livre (prova em tubo), é uma substância similar à trombina e está presente em filtrados de cultivos. É secretada extracelularmente e reage com uma substância presente no plasma denominado Fator de Reação com a Coagulase – CRF, para formar um complexo que, por sua vez, reage com fibrinogênio, formando fibrina (coágulos).
- Quando uma suspensão em plasma do microrganismo produtor de coagulase é preparada em tubo de ensaio, forma-se um coágulo visível após o período de incubação.
UTILIDADE
- Separar as espécies de Staphylococcus de importância clínica, S. aureus – coagulase positiva, das demais espécies – coagulase negativa.
FÓRMULA / PRODUTO
- Plasma de coelho com EDTA liofilizado.
CONTROLE DE QUALIDADE
- Positivo: Staphylococcus aureus ATCC 25923
- Negativo: Staphylococcus epidermidis ATCC 12228
CONSERVAÇÃO E VALIDADE
- plasma antes e depois de reconstituído, deve ser mantido refrigerado.
- Validade: ver recomendações do fabricante.
INOCULAÇÃO
Coagulase conjugada:
- Traçar dois círculos com lápis de cera em uma lâmina de vidro;
- Colocar duas gotas de água destilada ou solução fisiológica estéreis dentro de cada círculo;
- Com auxílio de um fio bacteriológico agregar a colônia em estudo, homogeneizando delicadamente em cada círculo;
- Colocar uma gota de plasma para a prova de coagulase em um dos círculos;
- No outro círculo, adicionar outra gota de água destilada ou solução fisiológica estéreis, como controle;
- Homogeneizar com palito de madeira;
- Inclinar a lâmina delicadamente, para frente e para trás;
- Observar presença de aglutinação.
Coagulase livre:
- Com auxílio do fio bacteriológico, suspender colônias em estudo em caldo BHI e colocar em estufa à 37ºC até que turve;
- Se necessário, acertar a turbidez até 0,5 da escala de MacFarland;
- Em um tubo de ensaio estéril, colocar 0,5 ml de plasma reconstituído e 0,5 ml do caldo BHI com crescimento bacteriano recém turvado;
- Incubar em estufa à 35ºC 4 horas;
- Verificar se há presença de coágulo;
- Se não houver presença de coágulo, incubar o tubo em temperatura ambiente e repetir as leituras com 18 e 24 horas de incubação.
INTERPRETAÇÃO
Coagulase conjugada:
- Positiva: formação de precipitado branco e aglutinação dos microrganismos da suspensão, após 15 segundos, no círculo que contém o plasma.
- Negativa: ausência de aglutinação no círculo que contém o plasma.
- Controle sem plasma: deverá ser leitoso e uniforme, sem presença de precipitado ou aglutinação.
A presença de precipitado ou aglutinação, torna a prova inespecífica, devendo ser repetida a prova
em tubo.
Coagulase livre:
- Positiva: presença de qualquer grau de coágulo.
- Negativa: ausência de coágulo.
RECOMENDAÇÕES
- Para a coagulase em tubo, as provas negativas após 4 horas a 37ºC, os tubos devem ser mantidos em temperatura ambiente, pois a incubação prolongada a 37ºC podem produzir fibronolisinas, o que causa dissolução do coágulo durante a incubação.
- Durante a leitura inclinar o tubo delicadamente e não agitar, pois a agitação pode desmanchar os coágulos parcialmente formados.
- Recomenda-se o uso de plasma de coelho com EDTA.
- Não utilizar plasma citratado, pois os microrganismos capazes de metabolizar o citrato (como os Enterococcus), darão resultados positivos se, forem confundidos com estafilococos.
- Plasma humano não é recomendado, pois contém quantidades variadas de Fator de Reação com a Coagulase e de anticorpos antiestafilococos, podendo dar uma prova falso/ negativa.
PROVA DE GELATINASE
PRINCÍPIO
- Determina a habilidade do microrganismo de produzir enzimas proteolíticas (gelatinases) que liquefaz/hidrolisa gelatina.
UTILIDADE
- Identificar e classificar bactérias fermentadoras, não fermentadoras e bacilos Gram positivos esporulados.
FÓRMULA / PRODUTO
- Filme não revelado de Raio X.
- Salina 0,9 % estéril ou água destilada estéril.
PROCEDIMENTOS
- Cortar a fita de filme de Raio X em tamanhos de aproximadamente 5 mm X 1 cm;
- Armazenar em frasco estéril.
CONTROLE DE QUALIDADE
- Positivo: Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853.
- Negativo: Escherichia coli ATCC 25922.
INOCULAÇÃO
- Em um tubo 13 x 100 mm, colocar 1,0 ml de salina 0,9% estéril ou água destilada estéril.;
- Com o auxílio de uma alça bacteriológica, fazer um inóculo denso da bactéria a ser testada, adicionar uma fita de raio x. Fazer o inóculo de colônias de crescimento de 18 a 24 horas;
- Realizar um tubo controle, com salina 0,9% estéril ou água destilada estéril e a fita de Raio X, sem inóculo.
INTERPRETAÇÃO
- Positivo: emulsão de gelatina (cor verde) na porção submersa do filme torna-se transparente (clara).
- Negativo: fita permanece verde, emulsão esverdeada permanece na porção submersa do filme.
CONSERVAÇÃO E VALIDADE
- Fitas: seguir instruções do fabricante.
RECOMENDAÇÕES
- Utilizar filme de Raio X não revelado.
ÁGAR CITRATO SIMMONS
PRINCÍPIO
- Verifica a capacidade da bactéria de utilizar o citrato de sódio como única fonte de carbono, juntamente com sais de amônia, alcalinizando o meio.
UTILIDADE
- Diferenciar gêneros e espécies de enterobactérias e não fermentadores.
FÓRMULA / PRODUTO
- Meio comercial: Citrato Simmons.
PROCEDIMENTOS
- Pesar e hidratar o meio segundo instruções do fabricante;
- Ajustar o pH para 6,9 ±0,2;
- Aquecer sob agitação até fundir o ágar;
- Distribuir em tubos com tampas de rosca;
- Esterilizar em autoclave;
- Retirar os tubos da autoclave e incliná-los ainda quentes, para que solidifiquem com a superfície em forma de bico de flauta (ângulo de 45°). Deixar solidificar em temperatura ambiente.
CONTROLE DE QUALIDADE
- Positivo: Klebsiella pneumoniae ATCC 13883.
- Negativo: Escherichia coli ATCC 25922.
INOCULAÇÃO
- Com o auxílio de um fio bacteriológico, inocular na superfície a colônia, não furar a base;
- Realizar o teste com colônias puras de 18 a 24 horas.
INTERPRETAÇÃO
- Cor original do meio: verde
- Positivo: cor azul ou crescimento no local do inóculo.
- Negativo: não há crescimento e a cor permanece inalterada.
- Se houver crescimento visual na área do inóculo sem mudança de cor, o teste pode ser considerado positivo, reincubar por 24 até 72 horas, a incubação poderá mudar a cor do meio para alcalino (azul).
Leitura inicial com 24 horas:
- Se resultado positivo: encerrar o teste.
- Se resultado negativo ou houver dúvida: reincubar por mais 24/48 horas.
Leitura com 48 horas:
- Se houver crescimento visível na área do inóculo sem mudança de cor, o teste pode ser considerado positivo, (encerrar o teste).
- Se resultado negativo ou houver dúvida, reincubar por 24 até 72 horas, a incubação poderá mudar a cor do meio para alcalino(azul).
CONSERVAÇÃO E VALIDADE
- Conservar de 4 a 10°C de 6 a 8 semanas;
- Após este período realizar controles negativo e positivo semanalmente.
RECOMENDAÇÕES
- Manter a tampa do tubo frouxa, o meio necessita de oxigênio.
- Não se devem transportar colônias de meios que contenham glicose ou outros nutrientes/substratos, pois podem entrar em contato com o meio de citrato, podendo dar um resultado falso positivo.
- Se algum resultado estiver duvidoso, inocular um novo tubo e incubar em temperatura ambiente (22 a 25°C) por até 7 dias.
- Não usar repiques de caldo.
- Deixar o tubo em temperatura ambiente antes de inocular a bactéria.
- Para fazer o inóculo flambar o fio bacteriológico.
- Não fazer inóculo muito denso (pode acidificar o meio deixando-o amarelo).
ÁGAR BÍLIS-ESCULINA
PRINCÍPIO
- A prova de Bile-Esculina é baseada na capacidade de algumas bactérias hidrolisarem esculina em presença de bílis. A esculina é um derivado glicosídico da cumarina. As duas moléculas do composto (glicose e 7-hidroxicumarina) estão unidas por uma ligação éster através do oxigênio. A esculina é incorporada em um meio contendo 4% de sais biliares.
- As bactérias Bile-Esculina POSITIVAS, são capazes de crescer em presença de sais biliares. A hidrólise da esculina no meio resulta na formação de glicose e esculetina. A esculetina reage com íons férricos (fornecidos pelo composto inorgânico do meio - o citrato férrico), formando um complexo negro.
UTILIDADE
- Separação dos Streptococcus Bile-Esculina positiva dos Bile-Esculina negativa.
- Identificação dos Enterococcus spp., que são Bile-Esculina positiva.
- Identificação de bacilos Gram negativos não fermentadores e enterobactérias, usar o meio sem bílis (vide prova de esculina).
FÓRMULA/ PRODUTO
- Meio comercial: Ágar Bílis-Esculina
Fórmula:
- Peptona 5 g
- Extrato de carne 3 g
- Bílis 40 g
- Esculina 1 g
- Citrato férrico 0,5 g
- Ágar 15 g
- Água destilada 1000 ml
- pH = 7,0
PROCEDIMENTOS
- Pesar e hidratar o meio conforme instruções do fabricante;
- Fundir o meio;
- Distribuir 2,5 ml por tubo;
- Esterilizar em autoclave;
- Após retirar da autoclave, inclinar os tubos ainda quentes para que solidifiquem com a superfície em forma de "bico de flauta" (ângulo de 45º).
CONTROLE DE QUALIDADE
- Positivo: Enterococcus faecalis ATCC 29212.
- Negativo: Streptococcus pyogenes ATCC 19615.
CONSERVAÇÃO E VALIDADE
- Conservar de 4 a 10°C por 4 meses.
INOCULAÇÃO
- Estriar a superfície inclinada do meio;
- Incubar a 35ºC 24 horas.
INTERPRETAÇÃO
Cor original do meio: acinzentado
- Positivo: Enegrecimento em pelo menos metade ou mais do meio.
- Negativo: Ausência de enegrecimento ou crescimento de menos da metade do meio após 72 horas de incubação.
RECOMENDAÇÕES
- Provas negativas com 24 horas de incubação, recomenda-se período de incubação maior (48 horas).
- Alguns Streptococcus do grupo viridans (cerca de 3%) podem hidrolizar a esculina em presença de bílis se incubados em atmosfera de CO2.
ÁGAR SANGUE - CAMP
PRINCÍPIO
- Consiste na interação da beta hemólise secretada pelo Staphylococcus aureus com o microrganismo em estudo, que secreta uma proteína, denominada "fator CAMP", produzindo aumento de hemólise no local da inoculação.
UTILIDADE
- Separação do Streptococcus beta hemolítico presumível do grupo B de Lancefield (S. agalactiae) e da Listeria monocytogenes (CAMP positivos) dos demais Streptococcus beta hemolíticos e espécies de Listeria.
FÓRMULA/ PRODUTO
Para esta prova utiliza-se:
- Placa de meio Ágar Sangue.
- Cepa de Staphylococcus aureus produtora de beta hemolisina ATCC 25923.
CONTROLE DE QUALIDADE
- Positivo: Streptococcus agalactiae ATCC 13813.
- Negativo: Streptococcus pyogenes ATCC 19615.
INOCULAÇÃO
- Com auxílio do fio bacteriológico, semear na superfície de meio Ágar Sangue a cepa de Staphylococcus aureus com uma única linha reta;
- Novamente com o fio bacteriológico (flambado), tocar nas colônias em estudo;
- Semear uma única linha reta na superfície do meio Ágar Sangue, perpendicularmente à linha de semeadura do S. aureus, sem tocar no inóculo do S. aureus;
- Logo em seguida, sem flambar o fio, picar o meio Ágar Sangue duas vezes, uma de cada lado da semeadura da cepa em estudo, sem tocar nas duas linhas de inóculo já feitos (a do S. aureus e da cepa em estudo);
- Incubar à 35ºC 24 horas.
(a) Inóculo do S. aureus
(b) Inóculo da cepa em estudo
INTERPRETAÇÃO
- Positivo: Aumento da área de hemólise em forma de flecha no local onde estão mais próximas as duas estrias de crescimento.
- Negativo: Ausência de aumento da hemólise. Observa-se nitidamente a hemólise do S. aureus e da cepa em estudo, inalteradas.
RECOMENDAÇÃO
- Não utilizar cepas velhas de S. aureus, pois podem não produzir beta hemolisina.
- Não tocar as estrias da semeadura das cepas, para não dar um resultado falso – negativo.
- Não utilizar placas de Ágar Sangue velhas que dificultem a leitura da prova, já que é baseada na hemólise das cepas.
